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没有脂质递送,就没有mRNA疫苗

发布时间:2021-08-16   点击次数:96次

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2019年,病毒凶猛,短时间重创全球。病毒COVID-19通过刺突蛋白S蛋白S1亚基的受体结合位点(RBD)与受体血管紧张素转换酶2(ACE2)的结合介导进入细胞内部。针对这些,各国相继加入疫苗的研制。


2020年,60多个候选疫苗批准进入临床试验,其中mRNA核酸疫苗等疫苗获批紧急使用或附条件上市。与传统疫苗相比,mRNA疫苗有很多优势,如制备安全、高效及质量可靠。脂质递送技术应用于mRNA疫苗,mRNA疫苗只是脂质包裹的一段mRNA分子,其中的mRNA分子进入人体后只是把携带的抗原信息传递出去,表达出抗原棘突蛋白。


现在全球已经有多家企业正在进行mRNA疫苗的研发。脂质递送技术也将获得更快发展。下面我们将对mRNA的研制难点,制备工艺及主要辅料等作一个简要的介绍。


01

mRNA**疫苗研制的主要难点


mRNA疫苗的研制面临三个主要难点:


1.1.mRNA非常脆弱,特别不稳定,非常容易降解。日常环境和身体中有很多酶能够迅速将它们降解。mRNA的不稳定对于药物递送是困难的。


1.2.mRNA在体内的有效靶向递送。


1.3.mRNA链是一个带有负电荷的长链大分子。在人体的细胞表面有一层也带有负电荷的细胞膜, mRNA很难穿过细胞膜达到细胞内部。


上述三个难点,脂质递送技术均能有效解决。脂质递送技术可以保护mRNA,防止降解,帮助它们进入人体细胞,有效靶向递送,协助它们指导细胞生成病毒蛋白。可以说没有脂质递送技术,就没有mRNA疫苗。


02

脂质递送技术简介


截至目前,脂质载体已成为递送 mRNA 为有效的非病毒载体。用于递送 mRNA 的脂质载体主要包括阳离子脂质体复合物 (lipoplex,LP)、脂质体聚合物(lipopolyplex,LPR)、脂质体纳米粒(lipid nanoparticle,LNP) 、纳米结构脂质载体(NLC)等,其中以脂质体纳米粒LNP应用的*为**。对于脂质体递送 mRNA 来说,不同的给药途径对诱导蛋白表达、给药频率及副作用强度具有重要影响。如 LNP 递送可通过改变给药途径来改变 mRNA 体内表达量和持续时间,其中肌注和皮内注射显示出比静脉注射更持久的蛋白表达。有文献报道mRNA-LNP 的外壳是单层的,但也有学者提出mRNA-LNPs 的外壳由一个或多个双层组成,可见目前的技术评估mRNA-LNP 壳的性质是困难的,可能存在多种类型的mRNA-LNP 结构,这取决于脂质的性质和mRNA-LNP 的制备方法。脂质体纳米粒 LNP外壳由不同的脂质组成,每种脂质都发挥着不同的功能,LNP表面主要是中性脂质和PEG化脂质以及部分可电离的阳离子脂质和胆固醇。在**内部,存在可电离的阳离子脂质、胆固醇(取决于其浓度)、水和 mRNA 的主要部分。


03

脂质递送技术在mRNA疫苗中的应用


mRNA 疫苗中,mRNA(信使核糖核酸)被包裹在脂质递送技术中,其为 mRNA 提供保护,并将其安全递送至人体细胞,使其在细胞中释放,使疫苗起效。通过非共价亲和力和细胞膜结合和内吞被摄取,进入细胞后 mRNA 逃离内吞小泡,被释放到细胞质中表达靶蛋白, BioNTech等均采用LNP技术。脂质递送也叫脂质体包埋,相当于一个基因疗法的变体,这个技术辉瑞疫苗包埋的完整性**只有75%,必须用**温冷藏。


LNP技术平台的其中一个关键辅料是可离子化的脂质。脂质传递系统的可离子化脂质的极性随着pH值的变化会改变,在低pH值的环境中,它携带正电荷,这让它们可以与mRNA形成复合体,起到稳定mRNA的作用。在生理pH值时,是中性,减少了它的毒副作用。在脂质传递系统的**,还包裹着聚乙二醇修饰的脂质分子(PEGylated lipid),聚乙二醇(PEG)的修饰,它防止脂质体聚集在一起,控制脂质体颗粒的大小,可起到防止脂质体被人体的免疫系统发现的作用。脂质传递系统中还包含胆固醇和其它辅助脂质分子,协助构成脂质传递的完整结构。脂质传递系统在碰到细胞膜时会被细胞吞入到细胞内形成称为内体(endosome)的囊泡。在细胞内部,内体的pH值会降低,导致可离子化的脂质分子携带正电荷,改变脂质传递系统的构象,促使mRNA从内体中解脱出来,与负责生产蛋白的核糖体结合,指导病毒蛋白的合成了。

04

mRNA疫苗的制备工艺


基于 mRNA 疫苗的研发,脂质递送技术已经被证实是用来递送 RNA 药物、疫苗的有效载**式。LNP含有多种成分,如何精确控制其组分、粒度、流量、形态等参数,同时还能确保质量,加快生产,这可能是 mRNA 疫苗生产**的难点。传统的脂质体生产方法,比如乙醇注入法、T型混合法、薄膜分散法、逆向蒸发法、化学梯度法、pH梯度法、硫酸铵梯度法、醋酸钙梯度法等,但是这些方法收率低,包封率低,难以用于大批量生产。有文献报道采用冲击式射流混合法可以实现大生产,利用 BlueShadow 80P 高压泵,让疫苗和脂质溶液形成两股射流,在腔体中进行对冲,利用流体动力学让脂质各个组分充分地混合,形成包裹mRNA的纳米脂质体颗粒。生产设备碰撞喷射混合器安装在洁净间(C级)内。通过中控平台控制工艺步骤中所有单元的流量。所有单元安装在不锈钢框架内,以适应药品生产中的 CIP清洁程序。该系统包括:KNAUER 碰撞喷射混合器(IJM), 脂质/乙醇混合物和 mRNA/缓冲液混合物的入口管路,脂质体出口管路,CIP在线清洁系统和不锈钢框架。


05

mRNA疫苗关键辅料


mRNA疫苗其辅料中的关键成分为构成LNP的脂质材料,其中包括阳离子脂质体,PEG化脂质体等,解决了mRNA大分子、不稳定、易降解的困难,并实现了mRNA有效地胞内递送。大部分脂质材料以进口为主,国内只有少量品种生产, 其中AVT 公司为国内主流脂质代理商。AVT 累计已经有多个在脂质体制剂中有所应用的磷脂类辅料在CDE获得了公示,DMG-PEG2000,胆固醇(供注射用),DLin-MC3-DMA,蔗糖(供注射用),海藻糖Hipo-S (供注射用),DSPE-MPEG2000(药用注射级)等脂质体递送关键辅料都有供应。目前 mRNA 疫苗的结构具有有不同的分子和配比结构,但辅料基本相同,主要包括以下几种:


5.1.阳离子脂质:与带负电的 mRNA 结合,可高效包载核酸药物,同时提供正电荷,与带负电荷的mRNA复合,有助于内涵体逃逸,mRNA体内转染,可离子化脂质具有pH敏感性。


5.2.胆固醇:稳定LNP结构;调节膜流动性,提高粒子稳定性。


5.3.辅助型脂质:常用DOPE,稳定粒子,破坏内涵体体稳定性,提高核酸递送效率


5.4.聚乙二醇化磷脂,延长代谢时间,提高粒子稳定性。减少粒子在体内与血浆蛋白的结合,延长体循环时间。


5.5.蔗糖,供注射用,提高LNP稳定性和mRNA疫苗的稳定性,防止脂质黏性过大。


06

mRNA疫苗脂质递送技术生产实例


mRNA疫苗非活性成分:


一:LNP技术,膜骨架DSPC,阳离子脂质ALC-0315,PEG化脂质ALC-0159,胆固醇;蔗糖;盐类,氯化jia,氯化钠,磷酸二qin钾,二水合磷酸氢二钠。


二:LNP技术,膜骨架DSPC,阳离子脂质SM-102,PEG化脂质PEG2000-DMG,胆固醇;蔗糖;缓冲盐类,氨丁三醇,氨丁三醇盐酸盐,醋酸,醋酸钠。


辉瑞-BioNTech疫苗工艺过程:


原液制备:疫苗复杂生产一般从开始到结束为60天,其中30天用于测试。每月生产2-3亿支。细菌培养产生称为质粒的DNA环,其中包含冠状病毒基因。从主细胞库中提取质粒瓶,融化。经改造的大肠杆菌,将质粒带入细胞内。改造过的细菌被移至生长培养基中,然后在营养肉汤中发酵,每20分钟繁殖一次,并复制出需要的DNA质粒。化学法分解细菌,并从其封闭的细胞中释放出质粒。将质粒与先前的样品进行比较,确认冠状病毒基因序列没有改变,用酶切割并过滤,将纯化的DNA留在一升的瓶子中。每瓶将产生约150万剂。每个DNA瓶都被冷冻,使用酶将DNA转录成信使RNA或mRNA。测试所得的16升袋装的mRNA,将其冷冻。


脂质递送技术包裹:油性脂质体来保护mRNA并帮助其进入人体细胞。脂质体和mRNA的裸链通过碰撞喷射混合在一起,电荷将它们急速混合在一起,形成脂质体疫苗颗粒。


分装冷冻:每分钟575个小瓶的速度分装。疫苗冷藏为低温,但在装瓶过程中会快速升温,如果不在冷冻中的时间过长,mRNA将会变质。必须在短于46小时的时间将液态疫苗分装到小瓶中,马上进行深度冷冻。每195个装满的小瓶放置到一个小塑料托盘中,然后冷冻。


07

疫苗脂质递送技术的展望


目前,****依然蔓延,mRNA疫苗也将发挥更大的作用。作为重要的载体脂质递送技术也将获得更多关注,其制备工艺、制备材料及表面修饰等方面也会取得了较大的进展。据报导欧洲有工厂已投巨资进行扩产疫苗用特殊脂质。国内目前全球共有 15款mRNA 疫苗在研,其中CuerVac、Moderna、BioNTech被称为“mRNA国际三巨头"。 在国内,多家本土公司也在开发mRNA疫苗中,据了解,国内已有 8 家研发型 mRNA 疫苗企业,有3家已经处于临床阶段了。国内脂质类辅料需求量将暴增,能促进脂质递送技术的发展,加快相关大生产工艺设备的研制,促进脂质递送关键辅料的国产化。

参考资料:

1.Without these lipid shells, there would be no mRNA vaccines for COVID-19. Retrieved April 27, 2021, 

2. Let’s talk about lipid nanoparticles. Retrieved April 27, 2021

3.Aldosari et al., (2021). Lipid Nanoparticles as Delivery Systems for RNA-Based Vaccines. Pharmaceutics, 



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