上篇讲到脂质体辅料总览,磷脂类的辅料种类很多,我们将在后面的篇章具体描述。实际上脂质体的关键辅料只有两类,磷脂类和胆固醇。制备脂质体,胆固醇是不可少的辅料,除了温敏脂质体,为了降低相变温度时脂质体的稳定性,迅速释放药物,可不添加胆固醇。本篇主要介绍胆固醇的理化性质,制造及应用。
1.脂质体制剂,为什么胆固醇不可少
胆固醇属于两亲物质,同时具有亲油和亲水两种基团,但是其亲油性较亲水性强,与磷脂相互作用形成脂质体时可嵌入到磷脂分子之间,调节膜结构及性质,提高脂质体功能性。此外,还可调节磷脂双分子层膜的流动性,使膜通透性降低,减少药物渗漏;可使脂膜维持一定柔韧性,增强脂质体囊泡抗击外部条件变化的能力;还能对磷脂的氧化有一定保护作用。胆固醇对磷脂的相变具有双相调节作用。在相变温度以上时,胆固醇可抑制磷脂分子中脂肪酸烃链的旋转异构化运动,减少歪扭构象数量,从而降低膜的流动性;在相变温度以下时,胆固醇又可诱发磷脂分子的脂肪酸烃链产生歪扭构象变化,从而阻止胶晶态出现,减少刚性,增加柔韧性。胆固醇又有类似增塑剂样作用。在脂质体载体中提高胆固醇的比例可增加脂质体的稳定性,降低渗漏率。有报道,在制备脂质体时添加30-50%的胆固醇,可以提高脂质体的载药量和稳定性。所以在脂质体中胆固醇不可少。
2.胆固醇的理化性质
早在18世纪人们已从胆石中发现了胆固醇,1816年化学家本歇尔将这种具脂类性质的物质命名为胆固醇。胆固醇是一种环戊烷多氢菲的衍生物。胆固醇为白色粉末状固体,室温下稳定性较好,但对光敏感,因此应该避光、密封保存,保存得当,有效期可达5年。在三lv甲烷中易溶(1g/4.5ml),在yi醚中溶解(1g/2.8ml),在丙酮、乙酸乙酯或石油醚中略溶,在乙醇中微溶,在水中不溶(0.2mg/100ml)。
3.胆固醇的制造工艺
3.1动物组织提取
动物组织提取法是以新鲜动物内脏、骨髓及脑为原料,工艺为(1)浓缩提取:将猪牛羊脑子晒干粉碎放入浸泡罐提取,回收罐中回收,循环浸泡提取;(2)酸化:丙酮提取液滤出放入到反应罐中加入乙醇和硫酸加温酸化;(3)皂化:酸化的胆固醇过滤放入反应罐内加入乙醇和氢氧化钠加温皂化; (4)清洗:皂化后的胆固醇放入反应罐中加热,过滤,冷却结晶。此类工艺简单可行,是目前国内胆固醇的主要生产工艺,然而易受到原料供应的限制,且有残留致病基因的可能。
3.2羊毛脂提取
羊毛油脂是羊毛工业的副产品,羊毛油脂中胆固醇含量较高,约10%至15%,且成品低廉来源丰富,稳定性及安全性高,国外大部分胆固醇都是以羊毛脂为原料。但羊毛脂中的胆固醇多与羊毛脂酸结合以酯的形式存在,而且胆固醇类似物很多,所以要得到纯品,对技术要求很高。通过皂化工艺使胆固醇游离出来,皂化得到的胆固醇还含有大量的脱氢胆固醇、二氢胆固醇等类似物,因分子结构相似,性质相近,给分离带来困难,成为工艺难点和关键点。但是,随着对药品安全性的重视,羊毛脂来源的胆固醇必定会逐渐取代动物内脏来源的胆固醇。江西天新药业最新申请制备工艺如下:
(1)将羊毛脂、氧化钙、稀释剂、水及相转移催化剂混合,升温进行皂化反应,获得羊毛脂皂化产物;
(2)从羊毛脂皂化产物中分离获得羊毛脂醇;
(3)在水、乙醇、有机溶剂的存在下,使羊毛脂醇与氯化钙接触获得胆固醇氯化钙络合物;
(4)将胆固醇氯化钙络合物进行解络,固液分离获得胆固醇粗品;
(5)将胆固醇粗品与低级有机酸和低级醇混合溶剂混合,重结晶获得胆固醇成品。
4.胆固醇应该怎么选择
胆固醇可提高脂质体的稳定性,是制备脂质体*的物质。胆固醇辅料如何挑选,必须是已通过关联审评,注射级和高纯度。
艾伟拓代理的胆固醇,为日本进口,纯度高达99%,在国际上多个上市脂质体产品中长期应用。不同于大多数从动物内脏中提取胆固醇的工艺,艾伟拓供应的胆固醇采用的原料为羊毛脂,因此产品杂质相对较少,是脂质体研发和生产的*。DMF号:24780, EINECS号:200-353-2,备案登记号:F20170000106。
5.胆固醇在上市脂质体及工艺中的用法用量举例
制备普通载药脂质体,胆固醇(供注射用)是必须的添加物,用量一般为CHO:PC=0.3:1(摩尔比)。因PC和药物的不同,存在胆固醇的最佳用量。在一定范围内,脂质体的粒径、氧化稳定性、物理稳定性与胆固醇添加量成正相关,超出范围时,超过膜负荷,会造成部分脂质体破裂。另外,胆固醇的添加会对膜相变温度有一定影响,临界值以内使相变温度降低,临界值以上,使相变温度升高。形成脂质体结构时,胆固醇嵌插在磷脂双分子层上,因此可调节膜的流动性,作用随温度的不同而改变。在相变温度以上,它能使磷脂的脂肪酸链运动性减弱,从而降低磷脂分子的流动性;而在相变温度以下时,则可通过阻止磷脂脂肪酸链的相互作用,缓解低温引起的磷脂分子流动性剧烈下降。
胆固醇已广范应用于上市脂质体产品处方,并在多个临床阶段的脂质体项目中得以应用,如顺铂脂质体Lipoplatino ,多柔比星Doxil,两性霉素 AmBisome,柔红霉素DaunoXome,布卡因EXPAREL,维替泊芬Visudyne等。
胆固醇用法用量举例如下:
5.1两性霉素脂质体注射液(Ambisome,1990)
胆固醇用法:与磷脂和药物一起溶于有机溶剂,旋蒸、抽真空制膜。用量:52mg/瓶
5.2多柔比星脂质体注射液(Doxil, 1995)
胆固醇用法:注入法,与磷脂一起溶于有机溶剂,快速搅拌条件下缓慢匀速注入适当浓度的硫酸铵溶液。用量:3.19 mg/mL
5.3布卡因脂质体注射液(Exparel, 2011)
胆固醇用法:与磷脂--起溶于有机溶剂,快速剪切条件下与含有布卡因的水溶液混合、乳化形成初乳。用量:8.2mg/ml
6.在近期国内脂质体研发中的磷脂与胆固醇比例
查阅了近期国内脂质体研发报道,摘录制备工艺中磷脂与胆固醇比例举例如下:
谭李玉等制备了杜鹃兰酮脂质体,确定胆固醇与大豆磷脂质量比为1:8。
嵇晶等制备丹参总酚酸复合磷脂脂质体,磷脂与胆固醇质量比为3∶1。
屈晓梅等制备了舒马普坦脂质体,卵磷脂/胆固醇比5.4:1,。
张璐等制备了紫杉醇五味子乙素脂质体,磷脂44 mg、胆固醇8 mg。
王溪淼制备卡培他滨与奥沙利铂复方脂质体,磷脂与胆固醇之比为3:1。
邢宇等制备了银杏内酯B脂质体, 160 mg蛋黄卵磷脂、40 mg胆固醇。
王成祥等制备了盐酸阿霉素-黄芪甲苷脂质体,磷脂浓度为8 mg/mL,磷脂与胆固醇比为10∶1,药脂比为1∶5。
吕佳佳等制备紫杉醇/姜黄素双载药脂质体,磷脂浓度40 mg/mL,磷脂-胆固醇比4∶1,药脂比1∶40,水化介质为pH 6.5的PBS缓冲液。
胆固醇是脂质体制剂中的主要成分之一,对维持脂质体膜结构、稳定性等起重要作用。制备脂质体,必须选择通过关联审评,注射级和高纯度的胆固醇。现在胆固醇在脂质体制造中不可少,但即将部分替代或全部替代。已有报道采用与胆固醇结构相似且具一定药理活性的甾醇、皂苷类化合物替代脂质体处方中胆固醇,同样能形成性质良好的脂质体。
参考文献:
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