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脂质体转染实验中的DOTMA和DOPE有何作用?

发布时间:2022-02-18   点击次数:443次

 AVT为大家带来几款新型注射级阳离子脂质材料,包括DMG-PEG2000,DOTMA等,本期AVT小编给大家分享一下DOTMA和DOPE在脂质体转染实验中的应用,好奇的小伙伴速来围观!

 脂质体转染实验步骤

 脂质体(LR)试剂是阳离子脂质体DOTMA和DPE的混合物(1:1)。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中,是目前条件下最方面的转染方法之转染率高,优于磷酸钙法,比它高5-100倍,能把DNA和RNA转染到各种细胞。用LR进行转染时,首先需要优化转染条件,应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等,对每批LR都要做,先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间,DNA可从1-5ug和孵育时间6h,开始按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线,再选用LR和DNA两者佳的剂量,确定出转染时间,因LR对细胞有一定的毒性,转染时间以不超过24h为宜。

 细胞种类:C0-7、BHK、NIH-3T3、Hela和 Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。

 1、操作步骤(方法一)

 1)取6孔培养板,向每孔中加入2m1含(1-2)x105个细胞的培养基,37℃、18%C02培养基40%-60%汇合时。

 2)转染液制备:在聚苯乙烯管中制备以下两液(为转染1个空细胞所用的A液:用不含血清培养基稀释DNA使浓度为1-10ug,终量100u1。B液:用不含血清培养基稀释LR,使终浓度为2-50ug,终量100u1轻轻混合A液、B液,室温中置10-15min,稍后会岀现微浊现象,但并不妨碍转染

 3)转染准备:用2m1不含血清培养基漂洗2次,再加入1m1不含血清培养基

 4)转染:把AB复合物缓缓加入培养基中,摇匀,置37℃温箱中6-24h吸除无血清转染液,换入正常培养基继续培养

 5)其余处理:如观察、筛选、检测等与其他转染法相同

 6)注意:转染时切勿加血清,血清对转染效率有很大影响。

 2、快速脂质体转染法操作步骤(方法二)

 ●……将细胞以5x105个/孔接种于6孔板中培养24h,使其达到50%-60%板底面积。

 ●……在试管中配制DNA-脂质体复合物

a、在1m1无血清DMEM中稀释PSV1-neo质粒DNA或供体DNAb、旋转1s,再加入脂质体悬液,旋转。

c、室温下放置5-10min,使DNA结合在脂质体上。

 ●……弃去细胞中的旧液,用1m1无血清DMEM洗细胞1次后弃去,向每孔中直接加入1m1DNA-脂质体复合物,37℃培养3-5天再于每孔中加入含20%胎牛血清的DMEM,继续培养14-24h。吸出DEM-DNA-脂质体混合物加入新鲜含10%胎牛血清的DMEM,2m1/L,再培养24-48h。用细胞刮或消化法收集细胞,以备分析鉴定

 3、稳定的脂质体转染法

 ●……接种细胞同前述,细胞长至50%

 ●……DNA-脂质体复合物制备转染细胞同前。

 ●……在每孔中加入1m1含20%胎牛血清的DMEM,37℃培养48h。

 ●……吸出DEM,用G418选择性培养基稀释细胞,使细胞生长一定时间筛选转染克隆,方法参照细胞克隆筛选法进行。

 细胞转染技术总述

 一、细胞转染途径

 转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于物理介导技术;化学介导方法很多,如经典的磷酸钙共沉淀;

 脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术;生物介导方法,有较为原始的原生质体转染,和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术

 1、物理介导

 1)电穿孔法:靠脉冲电流在细胞膜上打孔而将核酸导入细胞

 优点:转染效率较高

 缺点:需要昂贵的仪器(电穿孔仪);对细胞的损伤较大,每次转染需要

 更多的细胞和DNA;每种细胞电转的条件都需要进行多次优化

 2)显微注射:借助显微注射器直接把DNA注入核内,使之整合入受体细胞基因组中

 优点:转染效率高,可用于瞬时转染和稳定转染

 缺点:导入DNA时需要一个细胞一个细胞注射,不适合大量转染

 3)基因枪:依赖携带了核酸的高速粒子将核酸导入细胞内2、化学介导

 2、化学介导

 (1)磷酸钙共沉淀法

 磷酸钙有利于促进外源DNA与靶细胞表面结合,氯化钙+DNA+磷酸缓冲液按定的比例混和,形成极小的磷酸钙-DNA复合物沉淀黏附在细胞膜表面,借助内吞作用进入细胞质。沉淀颗粒的大小和质量对于转染的成功至关重要。

 优点:能用于任何DNA导入哺乳类动物,瞬时转染和稳定转染。

 缺点:转染效率低:进入细胞的DNA只有1 %- 5 %可以进入细胞核,其中只有不到1%的DNA可以与细胞DNA整合,在细胞中进行稳定表达。重复性不佳:pH值、钙离子浓度、DNA浓度、沉淀反应时间、细胞孵育时间乃至各组分加入顺序和混合的方式都可能对结果产生影响。

 (2)脂质体转染法

 中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA,借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体,DNA 并没有预先包埋在脂质体中,而是带负电的 DNA自动结合到带正电的脂质体上,形成DNA-阳离子脂质体复合物,从而吸附到带负电的细胞膜表面,经过内吞被导入细胞。

 优点:适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞,可用于瞬时转染和稳定转染;转染效率高,比磷酸钙法高5-100倍;能够把DN A和R N A转染到各种细胞,转染的稳定性好,可重复性高,转染时好不加血清和抗生素。

 缺点:阳离子脂质体细胞毒性相对较高,对部分细胞可能会干扰细胞的代谢。

 (3)多种阳离子物质介导

 DEAE-葡聚糖介导的转染,其原理还不清楚,可能是通过内吞噬作用而使DNA转导进入细胞核,此法只适合暂时转染实验,转染效率与DEAE-葡 聚糖浓度以及细胞与DNA/DEAE-葡聚糖混合液接触时间的长短很有关系,可采用较高浓度的细胞与DNA/DEAE-葡聚糖混合液接触时间的长短很有关系,可采用较高浓度的DEAE-葡聚糖(1g/L)作用较短时间(30 分钟-1.5小时),也可用较低浓度(250g/L)的DEAE-葡聚糖作用较长时间(8小时)。

 3、生物介导

 病毒介导的转染:以病毒作为载体,通过病毒感染的方式将外源DNA导入到细胞中,其中以逆转录病毒及腺病毒转染系统很是常用。

 优点:整和效率高,可使外源基因在宿主细胞中长期表达,适用于难以转染的原代细胞。

 缺点:存在潜在的安全危险性。

 二、理想的细胞转染方法

 理想细胞转染方法,应该具有转染效率高、细胞毒性小、重复性好、安全、简单等优点。病毒介导的转染技术,是目前转染效率zui高的方法,同时具有细胞毒性很低的优势。但是,病毒转染方法的准备程序复杂,常常对细胞类型有很强的选择性,在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法,则各有其特点。

 三、细胞转染分类

 瞬时转染:是指外源基因进入受体细胞后,存在于游离的载体.上,不整合到细胞的染色体上。

 稳定转染: DNA 整合到宿主细胞的染色体中。

 四、报告基因

 是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因,是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因,或与其它目的基因相融合,在调控序列控制下进行表达,从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控。

 常用的报告基因系统:半乳糖苷酶报告系统、素酶报告系统、蛋白报告系统(GFP)等。

 五、转染方法

 实验用的是Invitrogen公司的Lipofectamine2000在24孔板转染单层贴壁细胞。

 1、转染前1天将0.5~2X105细胞接种于24孔培养板,并加入500ul不含抗生素的完全培养基,以保证转染时细胞汇合达90~95%。

 2、准备复合物

 (1)将0.8ugDNA稀释于50ul无血清无抗生素的培养液中轻轻浑匀。

 (2)将 2ul Lipofectamine2000稀释于50u1无血清无抗生素的培养液中,轻轻浑匀,室温孵育5分。注意:必须在25分内进行。

 (3) 5 分后将它们混合,并轻轻浑匀,室温孵育20分。

 3、吸去培养板的培养基,用PBS或无血清培养基清洗细胞2次。

 4、将复合物(总体积100u1)加入培养孔,前后摇动培养板使其分布均匀。

 5、将细胞放入培养箱孵育4~6h后,可以更换含血清培养液去除复合物(也可不用)。

 6、24~ 48h后可以观察转入基因表达情况。

 7、稳定转染:换含血清培养基24h后将细胞以1: 10 (或更高比例)传代,1天后更换筛选培养基筛选。

 8、优化:要保证细胞汇合率达90~95% (比较高) ; DNA/ Lipofectamine2000比率1: 0.5~1: 5,一般细胞1: 2~3。

 

 

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