凡人修炼脂质体秘籍5----制备工艺篇

前面几篇已对脂质体的文献查阅，处方辅料等做了大量的描述，本篇对脂质体的制备工艺做专门的介绍。药物包封率、无菌性、药物保留性、制备方法和可否规模化生产，脂质体稳定性和成本及有效性都取决于脂质体中载药方法的选择。脂质体制备工艺的区别在于脂质从有机溶剂中干燥或分离然后再分散在水性介质中的方式。脂质体的主要制备工艺可分为主动载药法和被动载药法两种。被动载药法包括薄膜分散法、逆向蒸发法、二次乳化法、溶剂注入法、冷冻干燥法、熔融法去污剂除去法等。主动载药法包括PH值梯度法、硫酸铵梯度法、醋酸钙梯度法、离子载体法等。

1. *发布的指南文章对脂质体工艺要求

1.1国外有2015年 FDA Liposome Drug Products脂质体药物制药工业指南草案。

建议附上详细的工艺流程图和各操作点工艺监控参数变化范围及过程控制的描述。这些变化范围应基于药学开发的研究结果。

1.2国内在 2020-11-30 颁布了盐酸多柔比星脂质体注射液仿制药研究技术指导原则（试行）。

采用硫酸铵梯度法制备的主要步骤包括：1）空白脂质体的制备，2）硫酸铵梯度的形成，3）活性药物的装载。活性药物的装载是多柔比星在脂质体内外相的硫酸铵浓度梯度驱动下扩散到空白脂质体内完成的。应提供详细的生产工艺开发研究资料和工艺验证资料（包括无菌工艺验证资料）。建议制定合理的生产过程控制策略，如关键步骤的生产时限、关键中间体的质量控制标准和保持时限等。应特别关注生产工艺和批量对产品质量可控性的影响，注册批和商业批的生产工艺及批量原则上应保持一致。

1.3中国药审中心：2005年10月20日细胞毒类抗肿瘤药脂质体制剂专题会会议纪要 。

目前报道的制备方法(如高压乳匀过滤法、注入法、旋转成膜水化法)均有工艺放大的可行性，但在研究的初期，就需关注工业化大生产需配套的仪器设备以及关键工艺环节的研究。根据目前的研究经验，对于旋转成膜水化后的产品，一般都不是很均匀，都需要经过匀质化处理（如超声，高压乳匀）。 

1.4中国药审中心关于脂质体、乳剂注册申报注意事项文章：审评三部 张宁  注册分类五中的特殊情况。

对于制剂而言，处方工艺筛选是整个研究过程中的前期工作和重点工作，建议申办者能供详尽的处方工艺筛选过程,并附有翔实的试验数据和结果分析。如上资料，从申报者的角度考虑，是对最终确定的处方工艺的合理性进行充分的阐述，从审评者的角度考虑，这是评价的基础。其中，需提醒重点关注的是关于灭菌工艺的选择和验证，如上制剂由于辅料的不稳定性（例如磷脂易氧化降解）、剂型的不稳定性（例如乳剂的分层问题）等，导致灭菌工艺的选择比较困难，故提请申办单位对最终选择的灭菌工艺进行验证，证明所用灭菌工艺既能保证产品达到无菌效果，又不影响产品质量。

1.5中国药审中心2004年11月11日两个肿瘤药物脂质体品种的专家咨询会。

处方工艺的筛选指标应全面，需综合考虑包封率、渗漏率、粒径、稳定性（包括产品的稳定性和脂质材料的稳定性）等因素。对于关键的工艺条件和工艺步骤应进行验证，说明工艺的合理性和重现性。对所用的工艺设备应给予明确说明，并对放大生产的可行性进行论证。

1.6 CFDA 发布《药物注射剂研发技术指导意见》征求意见稿2018年

灭菌/无菌生产工艺是注射剂的关键工艺步骤，须依据灭菌决策树选择合理的灭菌/无菌生产工艺，对灭菌/无菌工艺进行验证，并提供在拟定的工业生产规模生产线进行的工艺验证方案和报告。关注特殊类型注射剂生产过程中影响制剂特性的工艺因素，对生产工艺进行验证，并提供在拟定的商业化生产线进行的工艺验证方案和报告。申报上市的注册批应该确实保证产品和工艺过程具有工业生产规模下的可行性，并提供验证资料。对特殊类型注射剂，注册批生产规模一般至少是工业生产规模的五分之一或至少生产1000支/瓶，两者中选较大者。对工业生产规模少于1000支/瓶的特殊品种，注册批生产规模应与工业生产规模一致。

2. 被动与主动载药工艺

药物加入脂质体有两种工艺。被动载药，药物在制备过程中被包封在脂质体里。主动载药，药物装载到完整的脂质体中。

2.1被动载药工艺

能否采用被动载药工艺，取决于脂质体在形成期间包封特定体积水相的能力，一般在水相中含有溶解的药物。亲水药物，经被动载药脂质体包封率与脂质体所在的水相体积有关，脂质体本身性质取决于分散体系的磷脂浓度、层室数和脂质体形态。亲脂性药物与磷脂双层有相互作用，包封率取决于磷脂类别及其浓度。形态学参数不影响药物包封率。使用被动载药技术，水溶性药物被包裹在脂质体的水相内，而脂溶性药物被包裹在脂质相中。药物脂溶性部分将嵌入脂质体磷脂之间，而它们的水溶性部分位于脂质体水相中，从而被包封。

2.2主动载药工艺

主动载药是将已经制备的空白脂质体与药物浓溶液混合，孵育后，药物扩散均匀分布在脂质体中。磷脂层对药物扩散具有高度渗透性，能获得较高包封率。由于浓度梯度，药物可通过脂质双层渗透到脂质体中，直到周围介质和脂质体内部之间达到平衡。主动载药，水溶性药物无法进入脂质体内部。能够进入脂质体的疏水性药物的量，取决于脂质双层的空间限制程度。对于两亲性药物的情况，它们难以保留在脂质体内，因为它们可以快速渗透脂质双层。主动载药的缺点在于它仅限一小部分表现为两性弱碱性或酸性的药物，只能在不带电的情况下渗透双层，而不能在带电的情况下渗透。

3.比较常用的制备工艺：

3.1溶剂注入法

溶剂注入法是比较常用的一种制备脂质体的方法，一般可将膜材分散在乙醇或Y醚中，再将溶液注入药物的水溶液中，挥尽溶剂后再匀化或超声就可得到脂质体。所得脂质体囊泡的平均直径与磷脂的性质、脂质与药物的比例，以及水相和有机溶剂组成有关。此方法相比于其他方法可以避免使用氯仿等有毒溶剂，并且以安全价廉的乙醇作为溶剂也更有利于大规模推广。但是该法目前也还存在溶剂残留难去除的问题。有人认为醚注入法优于乙醇注入法。

3.1.1乙醇注入法

含脂质的乙醇溶液快速注入过量的水相中。注入力须足以使溶液*混合。乙醇在水相中被稀释，使得脂质在水相中均匀分散。能制备小单层脂质体囊泡。此外，该方法简单易行，适用于敏感脂质，因为它可以防止其降解。缺点是磷脂在乙醇中溶解度有限同时脂质膜中乙醇不易*除去。

3.1.2醚注入法

将与脂质混溶的Y醚缓慢注入水相中，在一定温度下Y醚缓慢蒸发，导致醚与水的梯度延伸到界面脂质单层膜的两侧，形成的双层膜，折叠形成封闭的囊泡。此法能产生大的脂质体囊泡。醚注入法可避免了敏感的磷脂被氧化降解。缺点是单批脂质体所需的时间较长及需要小心控制脂质溶液的加入。

3.2薄膜分散法

薄膜分散法是将药物溶于有机溶剂后，减压除去溶剂，使脂质在容器壁上形成薄膜，再加入含有水溶性药物的缓冲溶液，充分振摇后得到脂质体。但是此法要使用大量的有机溶剂，耗时长。该法分散的磷脂会在水性缓冲液中产生形状和尺寸较大（直径为1-5μm）的多层脂质体。因此，需要使用超声处理或通过聚碳酸酯滤器的技术，来降低脂质体尺寸，产生尺寸更小、更均匀的脂质体。它的缺点是大多数水溶性化合物在溶胀过程中会被洗除，因此，只有10%-15%的水溶性物质可被包封。国内王溪淼用薄膜分散法制备卡培他滨与奥沙利铂复方脂质体。邢宇等用薄膜分散超声法制备银杏内酯B脂质体。

3.3逆向蒸发法

将膜材的有机溶液与药物水溶液超声形成W/O型乳液，再减压蒸发，就可得到脂质体。此法适用于水溶性药物和大分子活性物质。将磷脂与有机溶剂一起加入圆底烧瓶中。使用旋转蒸发仪在减压和控制温度条件下，通过蒸发除去溶剂。用氮气吹扫，并将脂质重新溶解在有机相中。异丙醚和二Y醚是这种脂质体制备方法的溶剂。在重新溶解脂质后，获得乳液。在减压下从乳液中除去有机溶剂后形成半固体凝胶。除去游离的或未包封的药物，获得的脂质体称为逆相蒸发脂质体。该法制备的脂质体药物的包封率较高。

3.4冷冻干燥法

冷冻干燥的方法可用于制备无菌和无热原的亚微米小尺寸脂质体。将磷脂/胆固醇溶解于适宜的有机溶剂中，常用的是叔丁醇，之后冷冻干燥得到疏松的粉末，将之水化后，则可以得到脂质体。得到的脂质体仍为纳米级的不均匀的脂质体。如需要，可以采取前述部分的方法，对其进行后处理。此种方法可以产业化，并且使用的叔丁醇毒性和乙醇相似，无安全问题。冻干制剂临床使用前进行超声处理。例如张晓云等人采用有机溶剂冻干法制得鬼臼毒素冻干脂质体，包封率达到93.72%。罗霄等人采用有机溶剂冻干法制备灯盏花素脂质体，制备3批脂质体，包封率平均为87.5%。

3.5超临界流体法

将压缩二氧化碳气体、有机助溶剂和脂质放入温度高于脂质转变温度的搅拌反应釜中，然后缓缓注入水相。当释放压缩气体降低压力时，形成脂质体。改良的超临界流体逆相蒸发技术可提高了载药效率和脂质体的稳定性。

已有报道采用亚临界或临界或超临界的二氧化碳作为溶剂生产脂质体的方法和专用设备。将脂质体的原料混合，如磷脂、胆固醇、脂溶性活性成份等混合后加入到可封闭的罐中，再向罐中加入CO2，并使罐中温度和压力达到亚临界或临界或超过CO2的临界温度和压力，溶解脂质体的原料后释放罐中的CO2，使罐中压力降低至略高于常压。向罐中加入分散液，浸泡或搅拌形成包裹有脂溶性活性成份的脂质体。

3.6 pH值梯度法

首先根据药物的性质选择内向缓冲液和外向缓冲液。如果药物为生物碱，则内向缓冲液则应为酸性缓冲液，外相缓冲液的pH值应接近生理pH值。通常使用的酸性缓冲液应为多元有机酸，如枸橼酸、酒石酸等；要求药物能够和有机酸根复合形成胶态沉淀。而外相缓冲液则应可以很好的溶解待包封药物，并且其pH能够保证绝大多数药物以非离解的形式存在，以便在加热孵育的过程中可以有效地穿透磷脂双分子层。筛选合适的内外相缓冲液的组合是非常重要的，因为它直接决定了药物在储存期内的稳定性和药物在体内的释放行为。确定内外相缓冲液后，就可以制备空白脂质体

筛选合适的内外相缓冲液的组合是重要的，因为它直接决定了药物在储存期内的稳定性和药物在体内的释放行为。

硫酸铵梯度是pH梯度常用的一种。以硫酸铵缓冲液为介质制备空白脂质体，经过透析后，在内外水相产生硫酸铵梯度，当脂质体双分子膜内的硫酸铵浓度远远大于外水相中的硫酸铵浓度时，内水相中的铵离子解离，从而使内水相pH降低，建立pH梯度。弱碱性药物以分子状态进入内水相，并在酸性条件下成盐，无法穿过磷脂双分子层返回外水相。药物成盐消耗掉内水相中的氢离子，从而使内水相pH增加，继续产生游离的氨分子。氨分子跨膜外逸形成pH梯度。上述过程不断进行直至内水相中氨离子消失，达到电化学平衡状态。与普通的pH梯度法相比，硫酸铵梯度法脂质体不易因外界pH的改变而泄露，被包裹入脂质体内水相的药物一般为弱碱性，可与硫酸根形成具有更低溶解性的盐，在脂质体内部聚集，使其比普通pH梯度法更加稳定，包封率更高。药物包封主要取决于内水相与外水相中硫酸铵浓度的比值。王绍宁等人分别采用薄膜分散法、逆相蒸发法、乙醇注入法和硫酸铵梯度法制备盐酸环丙沙星脂质体，结果表明硫酸铵梯度法制备脂质体的包封率（＞90 %），明显高于前3种方法制备得脂质体（＜40 %）。国外多柔比星脂质体注射液(Doxil, 1995)采用硫酸铵梯度法制备工艺。

蔗糖八硫酸盐梯度载药法近期也有一些报道。2015年上市的伊立替康脂质体Onivyde®，即采用蔗糖八硫酸盐梯度载药，使得伊立替康在弱酸性内水相中以沉淀形式被稳定包载。Onivyde®所用磷脂辅料DSPC、胆固醇、DSPE-mPEG2000以及蔗糖八硫酸酯盐，中国艾伟拓公司均完成/计划完成CDE和DMF登记。

此外制备脂质体的工艺还有复乳法、熔融法、表面活性剂处理法、离心法、前体脂质体法、钙融合法、加压挤出法、微射流法、膜接触器法、微流控，高压均质法等。

4.近期国内脂质体研究制备工艺

目前国内报道的脂质体制备工艺已薄膜分散法为多，还有逆向蒸发法，载体沉积法和冷冻干燥法等。

例如，嵇晶等用逆向蒸发法制备丹参总酚酸复合磷脂脂质体。张璐等用薄膜分散法制备紫杉醇五味子乙素脂质体。吕佳佳等用薄膜分散超声法制备紫杉醇/姜黄素双载药脂质体。周婷等用薄膜分散法制备羟基喜树碱脂质体。张丽用薄膜分散法并冷冻干燥制备卡巴他赛脂质体。沈贝莉莎用薄膜水化法并冻干制备紫杉醇脂质体。方晓旭等用冷冻干燥法制备硬脂醇半乳糖苷修饰的阿西替尼脂质体。隋琳等以载体为甘露醇，用载体沉积法制备两性霉素前体脂质体。

经过几十年的发展，脂质体制备工艺的研究已经取得很大的进步，切向流过滤法，薄膜分散法、逆相蒸发法、注入法、超声波分散法、pH梯度法、硫酸铵梯度法、醋酸钙梯度法及其他离子梯度法的相继问世拓展了脂质体工艺新思路。脂质体属于*靠工艺控制药品质量的产品；关键工艺步骤：如乳化工艺、溶剂去除工艺、载药工艺、过滤工艺等关键步骤最好全部自动化操作，杜绝人为因素引起的工艺偏差。相信随着制备工艺设备和条件的日益成熟，脂质体制备工艺水平将会有更广阔的发展空间。