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阳离子脂质材料DOTMA、DOPE脂质体转染实验步骤

发布时间:2021-05-25   点击次数:58次
   脂质体(LR)试剂是阳离子脂质体DOTMA和DPE的混合物(1:1)。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中,是目前条件下最方面的转染方法之转染率高,优于磷酸钙法,比它高5-100倍,能把DNA和RNA转染到各种细胞。用LR进行转染时,首先需要优化转染条件,应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等,对每批LR都要做,先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间,DNA可从1-5ug和孵育时间6h,开始按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线,再选用LR和DNA两者最佳的剂量,确定出转染时间,因LR对细胞有一定的毒性,转染时间以不超过24h为宜。
  细胞种类:C0-7、BHK、NIH-3T3、Hela和 Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。
  一、操作步骤:
  取6孔培养板,向每孔中加入2m1含(1-2)x105个细胞的培养基,37℃、18%C02培养基40%-60%汇合时。
  2)转染液制备:在聚苯yi烯管中制备以下两液(为转染1个空细胞所用的A液:用不含血清培养基稀释DNA使浓度为1-10ug,终量100u1。B液:用不含血清培养基稀释LR,使终浓度为2-50ug,终量100u1轻轻混合A液、B液,室温中置10-15min,稍后会岀现微浊现象,但并不妨碍转染
  3)转染准备:用2m1不含血清培养基漂洗2次,再加入1m1不含血清培养基
  4)转染:把AB复合物缓缓加入培养基中,摇匀,置37℃温箱中6-24h吸除无血清转染液,换入正常培养基继续培养
  5)其余处理:如观察、筛选、检测等与其他转染法相同
  6)注意:转染时切勿加血清,血清对转染效率有很大影响。
  二、脂质体快速转染法的操作步骤
  1)将5 105个细胞/孔接种到6孔板中培养24h,使细胞达到50%-60%的板底面积。
  2)在试管中制备DNA-脂质体复合物
  1.1)在1m1无血清DMEM中稀释PSV1-新质粒DNA或供体DNA
  1.2)旋转1s,然后加入脂质体混悬液,旋转。
  1.3)室温放置5-10分钟,使DNA与脂质体结合。
  3.弃去细胞内的旧液,用1m1无血清DMEM洗涤细胞一次,然后弃去细胞,直接向每个孔中加入1 m1脱氧核糖核酸-脂质体复合物,在37培养3-5天,然后向每个孔中加入含20%胎牛血清的DMEM,继续培养14-24小时。吸出脱氧核糖核酸脂质体混合物,加入含10%胎牛血清的新鲜DMEM,2m1/l,培养24-48h。通过细胞刮取或消化收集细胞用于分析和鉴定.
  三、稳定的脂质体转染方法:
  1)接种的细胞与上述相同,细胞生长到50%
  2)DNA-脂质体复合物转染细胞的制备同上。
  3)向每个孔中加入1m1含20%胎牛血清的DMEM,在37培养48h。
  4)吸出DEM,用G418选择性培养基稀释细胞,让细胞生长一定时间,筛选转染克隆。该方法按照细胞克隆筛选方法进行。
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