阳离子脂质材料DOTMA、DOPE脂质体转染实验步骤
更新时间：2021-05-25 点击次数：801次
脂质体(LR)试剂是阳离子脂质体DOTMA和DPE的混合物(1:1)。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方面的转染方法之转染率高，优于磷酸钙法，比它高5-100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。用LR进行转染时，首先需要优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1-5ug和孵育时间6h,开始按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间，因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24h为宜。
细胞种类：C0-7、BHK、NIH-3T3、Hela和 Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。
一、操作步骤：
取6孔培养板，向每孔中加入2m1含(1-2)x105个细胞的培养基，37℃、18%C02培养基40%-60%汇合时。
2)转染液制备：在聚苯yi烯管中制备以下两液(为转染1个空细胞所用的A液：用不含血清培养基稀释DNA使浓度为1-10ug,终量100u1。B液：用不含血清培养基稀释LR,使终浓度为2-50ug,终量100u1轻轻混合A液、B液，室温中置10-15min,稍后会岀现微浊现象，但并不妨碍转染
3)转染准备：用2m1不含血清培养基漂洗2次，再加入1m1不含血清培养基
4)转染：把AB复合物缓缓加入培养基中，摇匀，置37℃温箱中6-24h吸除无血清转染液，换入正常培养基继续培养
5)其余处理：如观察、筛选、检测等与其他转染法相同
6)注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。
二、脂质体快速转染法的操作步骤
1)将5 105个细胞/孔接种到6孔板中培养24h，使细胞达到50%-60%的板底面积。
2)在试管中制备DNA-脂质体复合物
1.1)在1m1无血清DMEM中稀释PSV1-新质粒DNA或供体DNA
1.2)旋转1s，然后加入脂质体混悬液，旋转。
1.3)室温放置5-10分钟，使DNA与脂质体结合。
3.弃去细胞内的旧液，用1m1无血清DMEM洗涤细胞一次，然后弃去细胞，直接向每个孔中加入1 m1脱氧核糖核酸-脂质体复合物，在37培养3-5天，然后向每个孔中加入含20%胎牛血清的DMEM，继续培养14-24小时。吸出脱氧核糖核酸脂质体混合物，加入含10%胎牛血清的新鲜DMEM，2m1/l，培养24-48h。通过细胞刮取或消化收集细胞用于分析和鉴定.
三、稳定的脂质体转染方法：
1)接种的细胞与上述相同，细胞生长到50%
2)DNA-脂质体复合物转染细胞的制备同上。
3)向每个孔中加入1m1含20%胎牛血清的DMEM，在37培养48h。
4)吸出DEM，用G418选择性培养基稀释细胞，让细胞生长一定时间，筛选转染克隆。该方法按照细胞克隆筛选方法进行。
