《mRNA-LNP疫苗的结构与稳定性》文献解读系列一

摘要：

当前mRNA脂质纳米粒(LNP)疫苗的一个缺点是它们必须在（超）di温下储存，了解这些疫苗不稳性的根本有助于我们合理提高mRNA-LNP产品的稳定性，从而降低对储存温度的要求。在这篇综述中，我们讨论了mRNA-LNP可能的内部结构、影响mRNA-LNP稳定性的因素以及优化mRNA-LNP产品稳定性的策略。对mRNA-LNP结构的分析表明，mRNA、可电离的阳离子脂质和水存在于LNP中，中性辅助脂质主要位于包裹的外壁。mRNA水解是mRNA-LNP不稳定的主要因素。目前尚不清楚LNP中的水如何与mRNA相互作用，以及mRNA的易降解位点通过与可离子化的阳离子脂质的结合而受到多大程度地保护。为了提高mRNA-LNP疫苗的稳定性，首先，应优化mRNA的核苷酸组成。其次，更好地了解mRNA在LNP中所处的环境可能有助于合理调整LNP结构以保持mRNA的完整性。此外，干燥技术如冻干，可能是仍有待探索的可行途径。

1、背景介绍

当下正在开发的许多疫苗中，有两款疫苗已在预防感中显示出高效保护率，这两款疫苗代着新一代疫苗产品：它们由脂质纳米粒包裹信使核糖核酸链（mRNA）。BioNTech/Pfizer和Moderna开发的这些mRNA疫苗的保护效力约为95%，并且是*获得FDA“紧急使用授权"和EMA “条件批准"的mRNA疫苗。疫苗mRNA编码SARS-CoV-2病毒的刺突(S)糖蛋白，其中包括两个脯氨酸替换（K986P和V987P突变），以稳定糖蛋白的融合前构象。在肌肉 (IM) 注射给药后，LNP系统使宿主细胞能够摄取并递送mRNA 到细胞质内，其中mRNA序列在核糖体中翻译成S蛋白。在宿主细胞进行翻译后加工后，S蛋白在细胞表面以其融合前构象作为膜结合抗原被呈递，为B细胞提供抗原靶标。此外，部分翻译表达的S蛋白进入抗原呈递途径，通过T细胞表位的组织相容性复合体（MHC）呈递提供T细胞的抗原识别。EMA评估报告将mRNA疫苗在注射部位的作用机制认定如下：“注射LNP包裹的mRNA疫苗会导致短暂的局部炎症，从而促使中性粒细胞和抗原呈递细胞(APC)募集到注射部位，招募的APC能够摄取 LNP纳米粒继而表达S蛋白，随后可以迁移到发生T细胞的局部淋巴结"，由于这种固有的先天免疫，没有必要用额外的佐剂配制mRNA疫苗。有趣的是，辉瑞/BioNTech和Moderna专门使用修饰后的核糖核苷酸来构建mRNA，以降低（而不是提高）mRNA固有的免疫原性，强调需要适当平衡mRNA疫苗的先天免疫活性（下文详细讨论）。体内抗原表达可以通过疫苗给药后来实现，与mRNA疫苗的自佐剂特性相配合，终产生有效地中和抗体应答和细胞免疫，从而为疫苗接受者降低感的风险。

与其他类型的疫苗相比，mRNA疫苗有几个优点。mRNA疫苗的一个普遍优势是它们的开发相对较快，因为mRNA-LNP是一种平台技术。在鉴定保护性蛋白抗原并对相应基因进行测序后，可在数周内制备mRNA。由于编码不同抗原的mRNA在化学和物理上高度相似，新mRNA疫苗的配方设计和制造过程遵循相同的步骤。与有复制缺陷的病毒型载体相比，mRNA疫苗可能有更高的病毒保护效力。与基于病毒载体的疫苗不同，机体不会对载体产生免疫反应。在这方面，mRNA疫苗类似于基于脱氧核糖核酸(DNA)的疫苗。然而，DNA疫苗仍有极小的机会进行潜在的基因组整合。此外，与mRNA疫苗相比，DNA疫苗在早期临床试验中显示出相当低的免疫原性，这可能是因为基于DNA的疫苗需要进入细胞核才能发挥作用，从而使有效递送变得复杂。总体而言，灵活的设计、标准化的生产流程和相对较短的细胞质存在时间使mRNA疫苗非常有优势，尤其是在病毒快速变异的大流行背景下。

然而，在开发 mRNA疫苗时遇到的挑战之一是它们的稳定性差。目前，大多数mRNA疫苗是通过肌肉注射给药的，在注射部位被宿主细胞摄取mRNA继而表达出抗原。mRNA疫苗的早期研究表明，裸露的mRNA在给药后会迅速降解。因此，在过去很多年，人们一直在努力改善体内给药后mRNA的稳定性，一种方法是通过优化mRNA结构的方法来减缓其降解。另一种成功且目前广使用的方法是用LNP将mRNA包封，从而保护 LNP中的mRNA。这减少了给药后mRNA过早的降解，并增强了向抗原呈递细胞胞内递送的能力。

尽管目前在提高mRNA-LNP疫苗的体内稳定性和功效方面取得了进展，但对其储存过程中的稳定性仍然关注较少。为了疫苗能有效地在全球范围内进行流通，mRNA-LNP疫苗能够在冷藏温度（2-8°C）或更高的温度下有足够长的有效期。目前，公开资料中几乎没有关于mRNA-LNP制剂长期储存稳定性数据。此外，尚不清楚在LNP中包封的mRNA会在多大程度上改善mRNA疫苗的储存稳定性。关于LNP包封mRNA的结构和形态、LNP组分的化学稳定性和mRNA-LNP系统的胶体稳定性也知之甚少。现在已知的是，为了更长时间地储存当前的mRNA疫苗，它们必须被冷冻。目前Moderna和BioNTech/辉瑞的疫苗分别需要在-15~-25℃和-60~-90℃储存，但迄今为止，这两家公司mRNA疫苗产品的降解过程和储存温度要求不同的原因尚不*清楚。

将mRNA-LNP需要冷冻储存阻碍了疫苗的流通。尤其是，需要储存在-60~-90 °C的极低温，对疫苗在全球运输、储存和流通是个极大的挑战。大多数其他疫苗可以在2–8 °C下储存。显然，当前迫切需要研发出性质更加稳定不需要冷冻储存的mRNA-LNP疫苗。本综述概述了使mRNA疫苗更稳定的方法，以便它们可以在不太的温度下储存更长时间。为了探讨该主题，讨论了mRNA-LNP疫苗的特性及其对储存稳定性的影响，以确定mRNA疫苗不稳定的原因并探索提高其稳定性的方法。