LNPs 作为递送系统
为了克服裸露的mRNA转染的种种问题，已经开发了保护性递送系统。目前的mRNA疫苗（表 1）都在使用 LNP 技术。这说明了使用LNP能在稳定mRNA 的同时并将其递送到细胞中。mRNA疫苗中的LNP 由四种主要成分组成（见表1）：中性磷脂、胆固醇、聚乙二醇 (PEG) 脂质和可电离脂质。可电离脂质含有带正电荷的可电离胺基团（在低 pH 条件下电离），可在颗粒形成过程中与阴离子mRNA 相互作用，并在细胞摄取过程中促进膜融合。此外，PEG化脂质用于控制粒径并充当空间屏障起稳定作用，防止储存过程LNP微粒聚集。通过使用微流控混合生产技术，这些脂质成分与 mRNA 一起形成大小约为 60-100 nm 的颗粒。例如，SARS-CoV-2 候选疫苗nCoVsaRNA和ARCoV的平均粒径分别为75 nm和89 nm。
表一：
LNPs与脂质体的不同之处在于微粒核中存在脂质，来自几项研究的数据表明水也存在于微粒内部某些空间。这意味着mRNA即使被包封也可能暴露于水性环境中。这种类型的内部结构，先前已在未包载和包载siRNA的LNP中被冷冻电镜所观察到。类似地，mRNA-LNPs 的冷冻电镜结果也显示了电子致密核，劳氏紫（Thionine）对RNA进行染色用于冷冻电镜对比度增强（见图2）。
尽管mRNA-LNP 的共同特征是脂质核，但该核的确切结构特征及其对脂质成分（摩尔比）和 mRNA 定位的依赖性仍存在争议（见图3）。正如 RiboGreen检测实验所确定的那样，mRNA 肯定位于 LNP 内部。RiboGreen 是一种染料，当与单链 mRNA 结合时会显示荧光，但不能进入 LNP。在 mRNA-LNP 制剂中，例如mRNA 疫苗的制剂，可与RiboGreen结合产生荧光的mRNA 比例非常低，因此，采用RiboGreen来测定的包封率通常 > 90%。综上所述，冷冻电镜（图2) 和包封率证据表明，mRNA-LNPs形成纳米粒子，其中包封了 mRNA，可免受外部介质的影响，LNPs包封的mRNA的结构有3种模型，这些主要来源于siRNA-LNPs分析（图3）。
图2 mRNA-LNP 的冷冻电镜图像显示具有明显不同电子密度的“囊泡"结构
图3 siRNA-LNP 和 mRNA-LNP 结构的推测模型的示意图 A：多层囊泡；B：纳米结构核；C：均质核壳
mRNA疫苗所包封的mRNA会影响终LNP的结构：siRNA 在结构和分子量大小上与 mRNA 有很大不同（表 2）并且N/P（可电离的阳离子脂质与核苷酸磷酸盐）摩尔比不同，N/P摩尔比分别为3和6（表 1）。mRNA 至少比 siRNA 大 100 倍，这会影响 LNP 的结构。此外，有迹象表明 mRNA 位于 LNP 的核，而siRNA 更靠近表面，mRNA 可以形成“囊泡"（图 2）。LNP 囊泡部分的组成是一个有争议的问题，在这种状态时：“mRNA 可以从带电的脂质中解离，留在充满溶剂的囊泡隔室中"。
表2 mRNA 和siRNA分子之间的差异
mRNA-LNP不太可能是（图 3A）的多层囊泡模型。它与mRNA-LNP的 TEM结果中电子致密核位置不对应。目前，大多数研究人员认为 mRNA-LNP 贴近核壳模型（图3 B和C），这意味着纳米颗粒具有表面层和无定形的各向同性核。Viger-Gravel等，使用核磁共振光谱证明LNP结构的两种类型的是可能的。
他们描述了一个被阳离子脂质包围（图3B)的包含水孔的无定形核模型。他们还假设中的脂质可以均匀分散，中间有“小水球"（图 3C）。后者（图3B和C）跟siRNA-LNPs和mRNA-LNPs在实验观察到的结果更吻合。
Arteta等人，使用冷冻电镜、小角 X 射线散射 (SAXS) 和小角度中子散射 (SANS) 测量 mRNA-LNP 结构模型。他们发现DSPC和PEG化脂质以及部分可电离的阳离子脂质和胆固醇是位于LNP 的表面，可电离的阳离子脂质、胆固醇（取决于其浓度）、水和 mRNA 的主要部分分布在内部。有趣的是，他们的研究表明，各向同性LNP 由24%（体积分数）的水组成。他们指出 mRNA 位于水柱内，水柱被阳离子脂质包围（如图4所示）。这意味着 mRNA 至少部分暴露于LNP 内部的水中，这可能导致mRNA在非冷冻条件下储存时不稳定，Sebastiani等人也报道了类似的结果。
因此，研究 mRNA 如何与 LNP 中的水和可电离的阳离子脂质相互作用是一件很有趣的事。mRNA 是亲水的，它可以通过静电和氢键与可电离的阳离子脂质相互作用（通常表观pKa < 6.5）。这取决于 LNP 内部的pH值，如果 LNP 外壳对质子具有渗透性——这很可能，因为 2-(对甲苯胺基)-6-萘磺酸 (TNS) 和劳氏紫等离子化染料可以进入 LNP ，那么LNP内部的pH值与制剂的其余部分应该相似，约为7 到 8，这意味着大多数可电离的阳离子脂质将不带电。
然而，由于可电离的阳离子脂质堆积在中，它们可能表现出聚电解质行为，导致 Henderson-Hasselbalch 方程的偏差，即滴定曲线的“拖尾"（脂质膜内的可电离脂质的表观pKa可能与实际值有较大偏差，这意味着pKa为6.5左右的可电离脂质在脂质膜内的表观pKa可能与理论值有1~2个pKa单位的偏差，所以pKa为6.5左右的可电离脂质在pH值为7-8之间的脂膜内时，依然有可能绝大部分呈现带正电的状态，注：红色斜体部分是对一些较复杂概念的进一步解读，后同）。此外，mRNA 和可电离的阳离子脂质之间的相互作用可能会影响电离行为。
对于 siRNA，发现与可电离阳离子脂质存在较弱的静电相互作用，这表明至少对于 siRNA-LNP 制剂，内部的pH值接近或等于外部的pH值。对于 mRNA-LNP，尚未进行此类实验研究。mRNA 和阳离子脂质复合的分子动力学模拟研究证明了脂质-脂质簇和脂质-mRNA 簇的形成。静电力和氢键都在驱动阳离子脂质和 mRNA 的相互作用。
图4 mRNA-LNPs中mRNA-水柱的示意图
Arteta 等人的另一个有趣发现是他们的mRNA-LNP 的外壳是单层的。其他研究人员根据冷冻电镜（图 2）或 SANS结果分析提出，mRNA-LNPs 的外壳由一个或多个双层组成。这些相互矛盾的发现表明，使用这些技术评估mRNA-LNP 壳的性质是困难的，可能存在多种类型的mRNA-LNP 结构，其结构取决于脂质的性质和mRNA-LNP 的制备方法。反过来，不同的结构可能会对不同配方的稳定性产生影响。总之，问题仍然在于目前我们尚不清楚 mRNA-LNP 的结构以及包封的mRNA 与各种脂质成分之间的相互作用。
对各种 mRNA疫苗成分的分析表明，它们具有共同特征，但也存在差异（表 1）。LNP 配方、修饰核苷的使用、高GC含量以及常规 mRNA 和 SAM 疫苗之间的长度差异可能会影响这些 mRNA疫苗在储存过程中的物理和化学稳定性。
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